确定了控制对慢性病毒感染的免疫应答的基因

 新浦京科学     |      2020-01-12

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疫苗是一种用于预防和治疗传染病或某些慢性疾病的生物制品,实际生产中应用最广泛的是传统灭活疫苗和减毒活疫苗,但两者在生产实际中均存在着有的免疫效果不确实、非特异性反应强、保护期短等缺点,这就使得新型疫苗的出现成为必然,各种新型疫苗的研制越来越多地受到关注。文章就目前出现的几类新型疫苗做了全面的分析和论述。

近20年来,芝加哥大学的微生物学家,遗传学家和免疫学家Tatyana Golovkina博士一直在研究一个特别棘手的问题:为什么有些人和动物能够抵御持续的病毒感染,而其他人则不能?

1 重组活载体疫苗

来自称为I / LnJ的菌株的小鼠特别擅长于此。它们可以通过产生特异性抗体来控制来自不同家族的逆转录病毒的感染,所述抗体覆盖病毒并使其无害。

活载体疫苗是将编码病原微生物特异性抗原的基因片段插入减毒的活细菌或病毒载体基因组的某些部位,使之高效表达,从而诱生强有力的抗体和细胞介导的免疫应答,使机体获得对插入基因相关疾病的抵抗力。

微生物学教授Golovkina对这些老鼠的特殊之处很感兴趣,因此她开始寻找导致其显着免疫反应的基因。在本周发表在Immunity杂志上的一项新研究中,她和她的同事们发现了这个基因。他们还开始发现更多线索如何控制抗病毒免疫反应。

1.1 重组细菌疫苗

使用称为定位克隆的过程,研究人员逐渐缩小基因在染色体上的位置,并将其精确定位于主要组织相容性复合体(MHC)基因座内。MHC基因座是与免疫系统有关的基因组的一个众所周知的区域,因此基因位于那里是有意义的,但这是一个令人不安的发现。

可作为基因工程疫苗载体的细菌很多,但从疫苗的安全性和能诱导特异性免疫反应的角度出发,减毒沙门菌和卡介苗是最佳载体。减毒沙门菌是最早用作活疫苗载体的病原菌之一。伤寒减毒疫苗株可经口腔、鼻腔及直肠等途径接种,该疫苗株具有在细胞内生存与繁殖的特性,因此能诱导机体产生较广泛的免疫反应,包括血清抗体、黏膜IgA及不同类型细胞介导的免疫反应[1]。自1981年开始,学者们将其作为构建基因工程疫苗的载体来表达外源基因产物,至今已有结核杆菌、霍乱弧菌、乙型肝炎、流感和血吸虫等数10种病原微生物的外源基因在沙门菌减毒活疫苗中获得了不同程度的表达。

起初这是一个令人失望的原因,因为MHC基因座内有大量基因都控制免疫反应,不仅对病毒,还有许多其他微生物病原体和非微生物病症,她说。大多数时候,当人们将基因定位到MHC时,他们放弃并停在那里,并假设该基因编码两种主要的MHC分子之一,即MHC I类或MHC II类。

但转化进入沙门菌的质粒有时不太稳定,疫苗在进入动物体内以后,沙门菌会丢失表达外源基因产物的质粒,并且沙门菌的蛋白质降解酶能把外源基因表达的蛋白质很快降解掉,因此尚有不少问题需要解决才能进入实际应用阶段[2]。

但是,在罗格斯大学的生物化学家Lisa Denzin和芝加哥丰田技术研究所的计算生物学家Aly Khan的帮助下,Golovkina和她的团队确定了一种名为H2-Ob的基因,可以实现这种抗药性。与另一种名为H2-Oa的基因一起,它在小鼠中产生一种叫做H2-O的分子,在人类中产生一种叫做HLA-DO的分子。

法国科学家Calmette和Guerin于1908年从患结核性乳腺炎的奶牛体内分离到1株牛型结核杆菌,并经多次传代制成能预防结核病的疫苗,被称为卡介苗(bacillus calmette-guerin,BCG)[3]。实践证明了卡介苗的安全性及其刺激产生的持久免疫效果,使卡介苗成了表达外源基因的理想载体,并以此来构建预防其他传染病的活疫苗。但是用卡介苗作为载体表达外源基因的疫苗在Ⅰ期和Ⅱ期临床试验中的初步结果并不十分理想,主要原因是卡介苗本身会在接种疫苗者的体内刺激产生很强的针对分支杆菌的免疫反应,而针对外源基因编码的抗原免疫反应却不太理想,这使得BCG重组DNA疫苗的临床应用进展缓慢。

多年来,H2-O一直被认为是MHC II类免疫反应的负调节因子,这意味着它会关闭免疫反应。大多数研究人员认为它可以防止自身免疫反应,这种反应可以攻击身体自身的组织。但在这种情况下,没有一只I / LnJ小鼠表现出自身免疫的迹象,因此H2-O必须有另一个目的。

  1. 2 重组病毒疫苗

Golovkina和她的团队发现了另一个有趣的事情,那就是他们越过I / LnJ小鼠,这些老鼠对感染具有更强的感染能力。得到的F1小鼠易受感染。这表明I / LnJ H2-Ob基因是隐性的;父母双方都必须有一个突变基因的拷贝才能将它传给后代,而该基因的产物应该是一种非功能性蛋白质。

以病毒为载体的基因工程疫苗可视为病毒减毒活疫苗和亚单位蛋白质疫苗的结合,既可避免亚单位疫苗需要佐剂及多次接种注射的缺点,又可诱导全面而持久的免疫反应,可作为减毒活疫苗的病毒载体有痘苗病毒、腺病毒、脊髓灰质炎病毒及单纯疱疹病毒等,其中最常用的是痘病毒和腺病毒。

这真是令人惊讶,Golovkina说。到目前为止发现的几乎所有病原体抗性机制都占主导地位,这意味着需要获得某些东西才能抵抗。

痘苗病毒是基因工程中的常用载体,是人类使用了近200年的最为安全的疫苗[4],而且牛痘苗病毒能感染许多不同类型的细胞,能容纳大分子外源基因,能在感染的早期或晚期高水平地表达外源基因,且病毒的耐热性强、易获得高效价的抗体等优点,是十分理想的载体。能表达牛瘟病毒血凝素或融合糖蛋白抗原的牛痘病毒基因工程疫苗,能产生高效价的中和抗体,并可使牛获得攻毒保护[5-7]是一个成功的例子。禽痘弱毒疫苗株已广泛用于生产禽病重组疫苗。1994年美国批准允许生产表达新城疫病毒的血凝素-神经氨酸酶蛋白和融合蛋白的双重组新城疫疫苗,成为第一个商业化重组病毒载体疫苗[8]。虽然牛痘病毒是理想的外源基因表达载体,但是这种基因工程疫苗只能经肌肉注射接种而不能用口服免疫的途径。

感染小鼠的免疫系统对病毒的反应持续三到四周,然后H2-O分子告诉它停止。但对感染做出剧烈反应的I / LnJ小鼠在H2-Ob上有一个突变,使其失活。因此,在他们发起免疫反应后,它永远不会关闭。这可以控制持续的逆转录病毒。

对于某些传染病,黏膜免疫的作用很重要,4型腺病毒疫苗和7型腺病毒疫苗已在美国军队中作为口服疫苗使用,证明是安全有效的。腺病毒是一种小DNA病毒,很容易在体外培养,在细胞分裂增殖时,病毒DNA的拷贝数很高,病毒的染色体有很强的启动子,可以插入长达7 000 bp外源基因序列。由于腺病毒有很多不同的血清型,因而可以用来加强免疫,前后两次接种的腺病毒血清型不同,可以避免由初次免疫产生的腺病毒抗体对加强免疫的腺病毒载体的抑制作用。然而,由于技术方面的原因,特别是能装配在基因组中的DNA插入子,由于其体积的严谨性,使构建重组腺病毒疫苗受到一定的限制。一般认为,表达外源蛋白的腺病毒适用于基因治疗中作为载体,由于腺病毒重组疫苗能产生强黏膜免疫反应,将会得到更广泛的应用。

Golovkina假设,虽然让免疫反应继续运行可以控制慢性感染,如逆转录病毒或乙型和丙型肝炎,其他病原体如结核病可以利用持续的免疫反应,因为他们可以获得某些细胞涂有抗体(I / LnJ小鼠恰好对结核病易感并产生抗结核抗体)。

2 树突状细胞疫苗

在这些基因进化过程中的某个时刻,能够关闭对某些感染(如细胞内细菌病原体)的免疫反应更为有利,但它的代价是无法与其他长期抗争感染。

树突状细胞(dendritic cell,DC)是动物体内功能最强大的抗原递呈细胞,具有摄取、加工抗原,以组织相容性复合体(MHCⅠ和MHCⅡ)肽结合物的形式递呈抗原并促进T、B淋巴细胞增殖的能力。研究发现DC能强有力地激活幼稚型T细胞,少量的抗原和少量的树突状细胞即足以激活T细胞[9-12],并且可诱导很强的初次免疫应答,前期的体外试验和动物试验表明,以适当形式的肿瘤抗原,不论是蛋白质、多肽还是核酸加载的DC疫苗都能够激活杀伤肿瘤细胞的抗原特异性T细胞,并可产生免疫记忆效应。荷载抗原的DC具有疫苗的功能,因此称为树突状细胞疫苗。

现在,她的团队已经确定了抗逆转录病毒的基因以及潜在的抗乙型肝炎和丙型肝炎的反应,Golovkina说应该进行进一步的研究,以创建基因疗法来操纵这种基因的功能,或开发出可能干扰该基因的分子。 H2-O的功能允许慢性感染者的病毒特异性反应。

DC疫苗主要有三大类,即细胞性肿瘤抗原修饰的DC,肿瘤抗原肽修饰的DC和肿瘤抗原基因转染的DC[13]。

在那之前,她将继续解决这个问题,就像她过去20年一样。

3 T细胞疫苗

我研究的方式非常持久,她说。如果我真诚地相信有一个非常有趣的生物学问题,没有什么能阻止我发现它。

T细胞疫苗指将能引起迟发型变态反应的T细胞作为疫苗接种,用于治疗某些自身免疫疾病。后来发现依据MHCⅠ类分子特异的多肽结合基序(MHC binding motif)合成的多肽,在体外诱导产生的抗原特异性细胞毒T细胞可用于治疗病毒性疾病,这种体外活化的T细胞也称为T细胞疫苗[9]。

由T细胞引起的迟发型变态反应可能是某些自身免疫疾病的病因,因此将可致病的T细胞灭活后作为疫苗注入体内,用于治疗某些自身免疫疾病[10]。小鼠变态反应性脑脊髓炎的实验已获成功,在人类多发性硬化症中也有一定效果。

病毒特异性的T细胞(cytoxic T lymphocyte, CTL)介导的细胞免疫具有清除病毒的功能,是宿主防御病毒感染的主要机制之一。传统病毒疫苗(减毒苗和灭活苗),含有完整的病毒蛋白以刺激机体产生抗体为主,难以有效诱导产生MHCⅠ类分子限制性的CTL和清除感染细胞内的病毒颗粒。T细胞疫苗是用多肽在体外诱导产生特异性CTL,经过克隆、扩增、筛选和鉴定后,将MHCⅠ类分子限制的CD8+T细胞输入机体,诱导产生细胞免疫应答[11]。

T细胞疫苗是近年来的新思路,它将T细胞从过去作为靶细胞转变为效应细胞,为疫苗的概念增添了新的内涵。T细胞疫苗能有效的激发机体特异性细胞免疫应答,而且直接回输CTL,可以人为控制CTL强度,既可避免其过高引起的细胞死亡,又可避免其过低无清除病毒作用。

4 食物疫苗

食物疫苗包括植物性食物疫苗和动物性食物疫苗两大类[14]。近年来随着分子生物学技术的飞速发展,通过基因工程改造的转基因动植物已成为一种新型的生物反应器,作为疫苗生产系统。

植物性食物疫苗的概念是由Mason等(1992)提出转基因植物时产生的,研究表明,细菌性和病毒性病原体抗原可以在植物中表达,且表达后的抗原仍能保留天然抗原的免疫原性[10]。利用植物病毒为载体,经遗传改建,使其携带外源抗原基因片段,此重组植物病毒感染植物组织后,通过在宿主植物中的增殖,得到外源抗原基因编码产物。也可将编码保护性抗原蛋白的结构基因克隆入Ti质粒,用重组质粒转化作物杆菌,然后再用携带重组质粒的作物杆菌感染植物细胞把导入的外源基因整合到这些植物细胞的染色体基因组中,含外源基因染色体的植物细胞在一定条件下可以生长成新生的植株,该植株可以在生长过程中表达外源基因,并将此性状传给子代,成为表达疫苗的品系[15]。

烟草是转基因植物研究的模式表达系统,已有多种外源基因在转基因烟草中成功表达,如乙型肝炎病毒表面抗原 (Hepatitis A virus surface antigen, HBsAg)、霍乱毒素B亚单位、nor-walk病毒膜蛋白等。特别是转基因植物口服疫苗的优势非常明显,水果、黄瓜、胡萝卜和番茄等植物是可以生食的,合适的抗原基因只要在该植物可食用部位的器官特异表达启动子驱动下,经转化得到的转基因植物即可直接用于口服免疫。在植物中高效表达产生的抗原作为食物时,可刺激体液和黏膜免疫应答并能安全通过动物消化道而不被蛋白酶降解,成为黏膜性抗原。Amtzen等将大肠埃希菌内毒素基因导入马铃薯中,得到的转基因马铃薯块茎被小鼠食用后在小鼠体内检测出内毒素的抗体。迄今为止,国外已经有几十种药用蛋白或多肽在植物中得到表达,有的已投入商品化生产。

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